En ce moment le plus terrifiant de l’année,
Nous avons décidé d’ouvrir et de feuilleter
Nos grimoires bien gardés
Entre la recette de filtre de solution de lavage
Et celle de la concoction de blocage
Voici la marche à suivre pour vos échantillons VIH en double marquage
Suivez la formule à la lettre
En maniant habilement votre pipette
Pour bien isoler
Les double-p24+ de vos échantillons VIH
Basé sur le travail de Pardons et al. (2019, PLoS Pathog) Single-cell characterization and quantification of translation-competent viral reservoirs in treated and untreated HIV infection
“La détection des cellules p24+ par cytométrie de flux dans les échantillons cliniques est techniquement difficile, car les anticorps spécifiques des protéines du VIH sont réputés pour leur spécificité limitée [Gadol, Crutcher & Busch, Cytometry. 1994; Kux et al. J Immunol Methods. 1996; Cameron et al. Cytometry. 1998].”
(Pardons et al. PLoS Pathog 2019; figure 2C)
Le HIV-Flow est une méthode simple et efficace de quantification des réservoirs du VIH compétents pour la traduction virale, en détectant les cellules exprimant la protéine de la capside virale (p24) par double marquage avec anti-p24-APC (Medimabs cat.MM-0289-APC) et anti-p24 KC57-PE (Beckman Coulter cat.6604667). Pour effectuer ce marquage intracellulaire, le kit de FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer (eBioscience cat.00-5523-00) est utilisé, selon les directives du fabricant. Cette approche de cytométrie en flux permet également de phénotyper ces cellules infectées.
(Pardons et al. PLoS Pathog 2019; figure 1C)
Il a été établi que le nombre médian de cellules p24+ par million de cellules T CD4+ (après stimulation PMA/Ionomycine) est de 4.3 dans les échantillons de participants sous ART, et de ~100 dans les échantillons de participants non traités.
Protocole de HIV-Flow (version détaillée disponible en ligne)
Jour précédent le marquage
- Décongeler les PBMC cryopréservées (entre 10 et 50 x 10^6 cellules), que ce soit provenant d’échantillons de participants sous ART ou non traités.
- Effectuer une sélection négative des cellules T CD4+
- Resuspendre les cellules T CD4+ à une concentration de 2 x 10^6 cellules/mL dans du RPMI + 10% de FBS + Pen/Strep + ARV (pour prévenir de nouvelles infections)
- Effectuer la stimulation :
- Pour les échantillons de participants sous ART : ajouter 162nM de PMA et 1µg/mL d’ionomycine, puis incuber à 37ºC pendant 24 heures.
- Pour les échantillons non traités : ajouter 25nM de PMA et 1µg/mL d’ionomycine, et incuber à 37ºC pendant 18 heures. Les échantillons non traités peuvent également être marqués sans stimulation préalable, mais nécessitent tout de même une nuit de repos après décongélation.
**Si vous utilisez le HIV Flow pour effectuer de l’immunophénotypage, ajoutez de la brefeldine A (BFA) dans le milieu de culture (dilution 2 000X) 1h avant la stimulation**
Le jour du marquage par anticorps
- Une fois les cellules stimulées, les récolter dans un tube FACS (maximum de 10 x 10^6 cellules par tube; 5 ml).
- Laver par centrifugation et pipetter le surnageant sans déloger le culot de cellules.
- Effectuer un marquage Aqua Live/Dead dans du PBS (volume final de 200 μl par tube FACS) pendant 20 à 30 minutes à 4ºC, à l’abri de la lumière.
- Ajouter 800 μl de PBS avec 4% de sérum humain (PBS/HS 4%) et laver par centrifugation.
- Effectuer le marquage extracellulaire dans du PBS/HS 4% (volume final de 100 μl par tube FACS) pendant 30 minutes à 4ºC.
- Ajouter 1800 μl de PBS/HS 4% et laver par centrifugation.
- Effectuer l’étape de fixation et perméabilisation en ajoutant 100 μl de tampon FoxP3 FixPerm pendant 45 minutes à 4ºC.
- Ajouter 1800 μl de tampon FoxP3 PermBuffer et laver par centrifugation.
- Effectuer le marquage intracellulaire dans le FoxP3 PermBuffer (volume final de 100 μl par tube FACS) pendant 45 minutes à température pièce.
Préparer une dilution des deux anticorps anti-p24 dans le FoxP3 PermBuffer, sans vortexer les anticorps ni les mélanges:
- Dilution I (anti-p24 KC57-PE): dilution 10 fois (1 μl d’anticorps + 9 μl de tampon FoxP3)
- Dilution II (anti-p24 28B7-APC): dilution 10 fois (1 μl d’anticorps + 9 μl de tampon FoxP3)
- Dilution III: ajouter 1 μl de chaque dilution d’anti-p24 par 100 μl (1 μl de Dilution I + 1 μl de Dilution II + 98 μl de FoxP3 PermBuffer)
**Veuillez noter que les anticorps anti-p24 doivent être titrés à la réception de chaque nouveau lot.**
- Ajouter 1800 μl de FoxP3 PermBuffer et laver par centrifugation.
- Resuspendre dans 100-200 μl de PBS pour l’analyse par cytométrie en flux.
Stratégie d’analyse du HIV-Flow
(Pardons et al. PLoS Pathog 2019; figure S13)
Population lymphocytaire SSC-A & FSC-A → Cellules uniques → Cellules Vivid- CD3+ → Cellules CD8- cells (inclus les cellules CD4+ and CD4- puisque la stimulation entraine la régulation négative du co-récepteur CD4) → Cellules doublement positives p24 (28B7+ et KC57+)
Nous vous souhaitons des sorts exaltants,
L’équipe technique répond, même aux tourments.
J’espère que l’expérience fut ténébreuse,
De nos contes du labo, où l’effroi s’infuse!